กระบวนวิชาเทคนิ คทางห้องปฏิบัติการชันสูตร 2 (510204

)
ภาคเรียนที่ 2

ปี การศึกษา 2550

ผู้สอน: ผศ.ดร.ร้ง้ สิร ิ โชติปฎิเวชก้ล

คณะเทคนิ คการแพทย์

มหาวิทยาลัยเชียงใหม่

E-mail: c_roongsiri@hotmail.com
วัตถุประสงค์การเรียนรู้
1.

เพื่อให้นักศึกษามีความรู้ ความเข้าใจในหลักการของวิธีโครมาโตกราฟี

แบบต่างๆ
2.

เพื่อให้นักศึกษาเข้าใจความหมายของศัพท์เทคนิ คพื้ นฐานที่

ใช้ในวิธีโครมาโตกราฟี แบบต่างๆ
3.

เพื่อให้นักศึกษาสามารถเลือกวิธีการแยกสารโดยโครมาโตกราฟี ที่

เหมาะสมได้

โครมาโตกราฟี (Chromatography)
Chromatography เป็ นเทคนิ คที่ นิย มใช้ใ นการแยกสารชีว
โมเลก้ล เนื่ องจากมีหลักการประย้กต์ใช้ได้หลากหลาย และสาร
ที่แยกได้น้ ั น สามารถนำามาวิเคราะห์หรือวัดปริมาณได้ทันที แล้ว
ยังสามารถเตรียมสารในปริมาณมากได้

ผ ล ลั พ ธ์ ข อ ง ก า ร แ ย ก ส า ร โ ด ย วิ ธี โ ค ร ม า โ ต ก ร า ฟี เ รี ย ก ว่ า

‘Chromatogram’

(รูปที่ 1)

1

a.

b.

ร้ปที่ 1 แสดงตัวอย่างของโครมาโตกราฟี 2 แบบคือ (a)โค
รมาโตกราฟี แบบคอลั ม น์ (Column chromatography)

แ ล ะ (b)โ ค ร ม า โ ต ก ร า ฟี แ บ บ แ ผ่ น ร ะ น า บ (Planar
chromatography)

(จ

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Chromatography ประกอบด้วย 3

ส่วนหลัก ได้แก่

1.

Stationary phase

2.

Mobile phase

3.

สารผสมที่จะนำามาแยก (Sample mixture)

การเคลื่อนที่ของโมเลก้ลสารถูกกำาหนดโดยสมด้ลระหว่างแรง 2 แรง

2

แรงฉ้ ด ของ mobile phase ซึ่ ง จะพาโมเลก้ ล ของสาร

-

เ ค ลื่ อ น ไ ป เ ร็ ว ห รื อ ช้ า ขึ้ น กั บ ค้ ณ ส ม บั ติ ก า ร ล ะ ล า ย (Liquid
chromatography) หรือการระเหย (Gas Chromatography)

-

แรงเหนี่ ยวรั้งของ Stationary phase ซึ่งจะดึงโมเลก้ลของ

สารที่เกาะไว้

สมด้ ล ของทั้ ง สองแรงนี้ จะแตกต่ างกั น ตามชนิ ด ของโมเลก้ ล สาร
จึงทำาให้โมเลก้ลของสารผสมนั้ น เคลื่อนที่ด้วยอัตราเร็วแตกต่าง
กัน จึงสามารถที่จะแยกสารผสมออกจากกันได้ (รูปที่2)

3

ร้ปที่ 2 แสดง Retension mechanism ในการแยกสารโดยวิธี
Chromatography แบบต่างๆ
(S= สารที่ต้องการแยก, ลูกศรไปกลับ = แรงระหว่าง mobile
phase และ stationary phase)
(จ

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Partition Chromatography

โมเลก้ลของสารผสมจะกระจาย (partition) ระหว่าง liquid

stationary phase และ mobile phase

mobile phase

อาจเป็ นของเหลว (LC, HPLC) หรือเป็ นกาซ (GLC)
Retention ขึ้นกั บสมด้ ลระหว่ างการละลายของโมเลก้ ล ใน
stationary phase และการเข้ ามาอยู่ ใ น mobile phase (รู ปที่
3)

4

ร้ปที่ 3

การละลายของโมเลก้ลสารใน stationary phase และ
การเข้ามาอยู่ใน mobile phase

(จ

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

[ความเข้มข้นของสารที่ละลายใน

Partition coefficient,
KD =phase]
stationary
[ความเข้มข้นของสารที่ละลายใน mobile
phase]
ตั ว อย่ า งของ Partition Chromatography ได้ แ ก่ Gas liquid
chromatography

(GLC),

paper

chromatography

และ Thin layer chromatography (TLC) บนตัวคำ้าจ้นมีประจ้
เช่น silica gel หรือ alumina
สำา ห รั บ

paper chromatography ห รื อ

TLC

mobile phase เป็ นสารผสมระหว่างตั วทำา ละลายมี ข้ ั ว เช่ น นำ้ า
และตัวทำาละลายไม่มีข้ ัวเช่น butanol

ตัวทำาละลายมีข้ ัวจะถูก

ดูดซับโดยตัวคำ้าจ้นมีประจ้เพื่อ form stationary phase ดังนั้ น
สารที่ ล ะลายในตั ว ทำา ละลายมี ข้ ั วก็ จ ะถู ก เหนี่ ยวรั้ง ไว้

ตั ว ทำา

ละลายมีข้ ัวนี้ จึงเรียกว่าเป็ น “retarder” ส่วนตัวทำาละลายไม่มีข้ ัว
จะอยู่ ร อบๆ stationary phase ดั ง นั้ นสารที่ ล ะลายในตั ว ทำา
ละลายไม่ มี ข้ ั ว ก็ จ ะเคลื่ อนที่ ไ ปก่ อ น ตั ว ทำา ละลายไม่ มี ข้ ั ว จึ ง
เรียกว่าเป็ น “mover”

5

Adsorption Chromatography
สารที่ ล ะลายใน liquid (หรื อ gas) phase จะ interact
กั บ ผิ ว ข อ ง ส า ร จำา พ ว ก Hydroxyapatite (Ca3(PO4)2,
Ca(OH)2), alumina (Al2O3), Magnesium carbonate ซึ่ ง
นิ ยมใช้เคลือบบนแผ่นแก้ว สำาหรับ TLC
หมู่ท่ีมีข้ ัวบนสารเคลือบแผ่นแก้ว จะสร้างพันธะไฮโดรเจน

กับสารที่ต้องการแยกซึ่งละลายใน organic solvent

การชะสารทำาโดยเพิ่ม potarity ของตัวทำาละลายเช่น ถ้าให้
acetonitrite (CH3CN) ก็ ใ ห้ เ ติ ม methanol (CH3OH) เพื่ อไป
แย่ ง จั บ กั บ สารเคลื อ บบนแผ่ น แก้ ว บางครั้ง ก็ ใ ช้ ก ารชะแบบ
Gradient (รูปที่ 4)

รู ป ที ่ 4 การชะแบบ Gradient (เพิ ม
่ /ลดความเข้ ม ข้ น ของ
Solvent เป็ นลำา ดับ โดยค่อยๆปล่อย Solvent 2 เข้ามาผสม
กับ Solvent 1)

(จ

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

6

Ion-exchange chromatography
สารจะถูกดึงไว้โดยแรงดึงดูดระหว่าง หมู่ บน stationary phase
ซึ่ ง มี ป ร ะ จ้ ต ร ง ข้ า ม กั บ ส า ร ที่ ต้ อ ง ก า ร แ ย ก

ion-exchange

chromatography มี 2 แ บ บ คื อ Anion-exchange แ ล ะ
Cation-exchange ซึ่ ง เรีย กตามประจ้ ข องสาร แต่ ค อลั ม น์ จ ะ
บรรจ้ด้วย stationary phase ที่มีประจ้ตรงข้าม (รูปที่ 5,6)

รูปที ่ 5

Ion-exchange chromatography

(จาก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.htm
l)

การชะสารทำาได้โดย
-

การเปลี่ ย นแปลง pH เพื่ อจะ neutralize หมู่ ท่ี มีประจ้

ทั้งที่อยู่บนโมเลก้ลของสารและบน stationary phase
-

เพิ่มความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ท่ีใช้ชะ เพื่อไปแทนที่อิออ

นที่จับอยู่

7

-

ใช้ pH หรือ salt gradient เพื่ อเพิ่ ม ประสิ ท ธิ ภ าพการ

แยก matrix ตัวกลางที่ใช้แยกสารแบ่งออกตามประจ้ ชัว่ คราว

รูป ที ่ 6 (บน) แสดงประจุ ของหม่่ ทีอ
่ ย่่ บน stationary phase
ที ่ นิ ย ม ใ ช้

ไ ด้ แ ก่

carboxymethyl (CM)

diethylaminoethyl (DEAE) กั บ

(ล่าง)

ของประจุที ่ pH ต่างๆ

8

แสดงการเปลีย
่ นแปลงความจุ

Gel filtration Chromatography
มี ชื่ อ เ รี ย ก อี ก อ ย่ า ง อื่ น ว่ า Gel permeation ห รื อ SizeExclusion chromatography มี ห ลั ก การแยกตามขนาด (และ
รูปร่าง) โมเลก้ลของสาร ดังรูปที่ 7 และได้ผลออกมาดังรูปที่ 8

ร้ปที่ 7 แสดงการแยกสารตามขนาดด้วยวิธี gel filtration
chromatography

(void volume = ปริ ม าตรของ mobile phase ก่ อ นที ่

สารจะออกมาจากคอลัมน์)

(จ

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

9

ร้ปที่ 8 Chromatogram ของวิธี Gel filtration
chromatography
(จาก

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

ส ภ า ว ะ ที่ ใ ช้ ใ น ก า ร แ ย ก จ ะ เ ป็ น แ บ บ mild, non-denaturing
conditions ซึ่งเหมาะสมสำาหรับการแยกโปรตีนที่มีน้ ำาหนั กโมเลก้ลต่างกัน
นอกจากนั้ นยังใช้สำาหรับ

การขจัดเอาเกลือออก (Desalting)

-

-

โปรตีนที่แยกโดยวิธีน้ ี ยังคงโครงร่าง Quaternary อยู่

-

สามารถใช้ ห า molecular weight ของสารได้ โดย

เทียบกับ standard protein ที่ทราบ molecular weight

10

(จาก

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

ชนิ ดของ matrix ที่ใช้ในการ form stationary phase :
- cross-linked dextran polymer (Sephadex G-

10 ถึง G-200)
- cross-linked polyacrylamide (Biogel P-2 ถึ ง

P-300)

Affinity chromatography

Retention เกิ ด จาก biospecific interaction ระหว่ า ง ligand
ซึ่งเกาะอยู่บน dextran หรือ cellulose matrix กับโมเลก้ลของ
สารผสม
ตารางที่ 1 แสดงชนิ ดของสารที่ต้องการแยกกับ ligand จำาเพาะที่
เคลือบบน Stationary phase

(จ

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

11

ligand

สารที่ต้องการแยก
enzyme

Substrate, coenzyme, reversible
competitor

antigen

Antibody

hormone

Receptor, binding protein

receptor

Effector molecules eg. hormone,
neurotoxin

การชะสารออก ทำาได้โดยการแทนที่ด้วยสารละลายที่มีอยู่ ligand
อยู่ แต่วิธีน้ ี สารที่ต้องการแยกจะจับกับ ligand ตอนถูกชะออก
มา จึงนิ ยมใช้การชะโดยการเปลี่ยนแปลง pH เพื่อไปรบกวนการ
จับระหว่าง ligand กับสารนั้ น

12

ร้ ป ที่ 9

การเชื่ อม ligand ให้ เ กาะอยู่ บ นผิ ว ของ matrix ใช้

cyanogen bromide
(จ า ก

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Qualitative Chromatographic analysis
- Paper & Thin Layer Chromatography
ระยะทางที่สารเคลื่อนที่

Retardation factor (Rf) =
ระยะทางที่ตัวทำาละลาย
เคลื่อนที่

เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานที่เคลื่อนที่ควบคู่กันไปข้างๆ

-

อาจมองเห็ น จ้ ด ที่ ส ารเคลื่ อนที่ ไปโดยการฉี ดพ่ น สาร (เช่ น

พวก ninhydrin สำาหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน)

13

Quantitative chromatographic analysis
- GLC and HPLC
ใช้วิธี calibrate เทียบกับ standard ทีท
่ ราบ
molecular weight แล้ววัดพืน
้ ทีใ่ ต้กราฟ (peak area)

(จ า ก

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

14

เครื่องมือ GLC and HPLC ปั จจ้บัน จะแสดงผล และคำาณวณความ
เข้มข้นของสารออกมาได้เลย

เอกสารอูางอิงและแนะนำาอ่านเพิ่มเติม
1.

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Sec

tion3/section3.html
2.

http://gc.discussing.info/gs/b_theory

3.

http://www.chem.vt.edu/chem-

ed/sep/tlc/tlc.html
4.

http://www.chromatography.co.uk/techniqs/Bio/

bio_003.htm

15

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful