You are on page 1of 15

กระบวนวิชาเทคนิ คทางห้องปฏิบัติการชันสูตร 2 (510204)

ภาคเรียนที่ 2 ปี การศึกษา 2550


ผู้สอน: ผศ.ดร.ร้ง้ สิร ิ โชติปฎิเวชก้ล คณะเทคนิ คการแพทย์
มหาวิทยาลัยเชียงใหม่
E-mail: c_roongsiri@hotmail.com

วัตถุประสงค์การเรียนรู้
1. เพื่อให้นักศึกษามีความรู้ ความเข้าใจในหลักการของวิธีโครมาโตกราฟี
แบบต่างๆ
2. เพื่อให้นักศึกษาเข้าใจความหมายของศัพท์เทคนิ คพื้ นฐานที่
ใช้ในวิธีโครมาโตกราฟี แบบต่างๆ
3. เพื่อให้นักศึกษาสามารถเลือกวิธีการแยกสารโดยโครมาโตกราฟี ที่
เหมาะสมได้

โครมาโตกราฟี (Chromatography)
Chromatography เป็ นเทคนิ คที่ นิย มใช้ใ นการแยกสารชีว
โมเลก้ล เนื่ องจากมีหลักการประย้กต์ใช้ได้หลากหลาย และสาร
ที่แยกได้น้ ั น สามารถนำามาวิเคราะห์หรือวัดปริมาณได้ทันที แล้ว
ยังสามารถเตรียมสารในปริมาณมากได้
ผ ล ลั พ ธ์ ข อ ง ก า ร แ ย ก ส า ร โ ด ย วิ ธี โ ค ร ม า โ ต ก ร า ฟี เ รี ย ก ว่ า
‘Chromatogram’ (รูปที่ 1)

1
a.

b.

ร้ปที่ 1 แสดงตัวอย่างของโครมาโตกราฟี 2 แบบคือ (a)โค


รมาโตกราฟี แบบคอลั ม น์ (Column chromatography)
แ ล ะ (b)โ ค ร ม า โ ต ก ร า ฟี แ บ บ แ ผ่ น ร ะ น า บ (Planar
chromatography) (จ า ก

http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Chromatography ประกอบด้วย 3 ส่วนหลัก ได้แก่


1. Stationary phase
2. Mobile phase
3. สารผสมที่จะนำามาแยก (Sample mixture)
การเคลื่อนที่ของโมเลก้ลสารถูกกำาหนดโดยสมด้ลระหว่างแรง 2 แรง

2
- แรงฉ้ ด ของ mobile phase ซึ่ ง จะพาโมเลก้ ล ของสาร
เ ค ลื่ อ น ไ ป เ ร็ ว ห รื อ ช้ า ขึ้ น กั บ ค้ ณ ส ม บั ติ ก า ร ล ะ ล า ย (Liquid
chromatography) หรือการระเหย (Gas Chromatography)

- แรงเหนี่ ยวรั้งของ Stationary phase ซึ่งจะดึงโมเลก้ลของ


สารที่เกาะไว้
สมด้ ล ของทั้ ง สองแรงนี้ จะแตกต่ างกั น ตามชนิ ด ของโมเลก้ ล สาร
จึงทำาให้โมเลก้ลของสารผสมนั้ น เคลื่อนที่ด้วยอัตราเร็วแตกต่าง
กัน จึงสามารถที่จะแยกสารผสมออกจากกันได้ (รูปที่2)

3
ร้ปที่ 2 แสดง Retension mechanism ในการแยกสารโดยวิธี
Chromatography แบบต่างๆ
(S= สารที่ต้องการแยก, ลูกศรไปกลับ = แรงระหว่าง mobile
phase และ stationary phase)
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Partition Chromatography
โมเลก้ลของสารผสมจะกระจาย (partition) ระหว่าง liquid
stationary phase และ mobile phase mobile phase
อาจเป็ นของเหลว (LC, HPLC) หรือเป็ นกาซ (GLC)
Retention ขึ้นกั บสมด้ ลระหว่ างการละลายของโมเลก้ ล ใน
stationary phase และการเข้ ามาอยู่ ใ น mobile phase (รู ปที่
3)

4
ร้ปที่ 3 การละลายของโมเลก้ลสารใน stationary phase และ
การเข้ามาอยู่ใน mobile phase
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

[ความเข้มข้นของสารที่ละลายใน
Partition coefficient, KD =phase]
stationary
[ความเข้มข้นของสารที่ละลายใน mobile
phase]

ตั ว อย่ า งของ Partition Chromatography ได้ แ ก่ Gas liquid


chromatography (GLC), paper chromatography
และ Thin layer chromatography (TLC) บนตัวคำ้าจ้นมีประจ้
เช่น silica gel หรือ alumina
สำา ห รั บ paper chromatography ห รื อ TLC
mobile phase เป็ นสารผสมระหว่างตั วทำา ละลายมี ข้ ั ว เช่ น นำ้ า
และตัวทำาละลายไม่มีข้ ัวเช่น butanol ตัวทำาละลายมีข้ ัวจะถูก
ดูดซับโดยตัวคำ้าจ้นมีประจ้เพื่อ form stationary phase ดังนั้ น
สารที่ ล ะลายในตั ว ทำา ละลายมี ข้ ั วก็ จ ะถู ก เหนี่ ยวรั้ง ไว้ ตั ว ทำา
ละลายมีข้ ัวนี้ จึงเรียกว่าเป็ น “retarder” ส่วนตัวทำาละลายไม่มีข้ ัว
จะอยู่ ร อบๆ stationary phase ดั ง นั้ นสารที่ ล ะลายในตั ว ทำา
ละลายไม่ มี ข้ ั ว ก็ จ ะเคลื่ อนที่ ไ ปก่ อ น ตั ว ทำา ละลายไม่ มี ข้ ั ว จึ ง
เรียกว่าเป็ น “mover”

5
Adsorption Chromatography
สารที่ ล ะลายใน liquid (หรื อ gas) phase จะ interact
กั บ ผิ ว ข อ ง ส า ร จำา พ ว ก Hydroxyapatite (Ca3(PO4)2,
Ca(OH)2), alumina (Al2O3), Magnesium carbonate ซึ่ ง
นิ ยมใช้เคลือบบนแผ่นแก้ว สำาหรับ TLC
หมู่ท่ีมีข้ ัวบนสารเคลือบแผ่นแก้ว จะสร้างพันธะไฮโดรเจน
กับสารที่ต้องการแยกซึ่งละลายใน organic solvent
การชะสารทำาโดยเพิ่ม potarity ของตัวทำาละลายเช่น ถ้าให้
acetonitrite (CH3CN) ก็ ใ ห้ เ ติ ม methanol (CH3OH) เพื่ อไป
แย่ ง จั บ กั บ สารเคลื อ บบนแผ่ น แก้ ว บางครั้ง ก็ ใ ช้ ก ารชะแบบ
Gradient (รูปที่ 4)

รู ป ที ่ 4 การชะแบบ Gradient (เพิ ม


่ /ลดความเข้ ม ข้ น ของ
Solvent เป็ นลำา ดับ โดยค่อยๆปล่อย Solvent 2 เข้ามาผสม
กับ Solvent 1)
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

6
Ion-exchange chromatography
สารจะถูกดึงไว้โดยแรงดึงดูดระหว่าง หมู่ บน stationary phase
ซึ่ ง มี ป ร ะ จ้ ต ร ง ข้ า ม กั บ ส า ร ที่ ต้ อ ง ก า ร แ ย ก ion-exchange
chromatography มี 2 แ บ บ คื อ Anion-exchange แ ล ะ
Cation-exchange ซึ่ ง เรีย กตามประจ้ ข องสาร แต่ ค อลั ม น์ จ ะ
บรรจ้ด้วย stationary phase ที่มีประจ้ตรงข้าม (รูปที่ 5,6)

รูปที ่ 5 Ion-exchange chromatography


(จาก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.htm
l)

การชะสารทำาได้โดย
- การเปลี่ ย นแปลง pH เพื่ อจะ neutralize หมู่ ท่ี มีประจ้
ทั้งที่อยู่บนโมเลก้ลของสารและบน stationary phase
- เพิ่มความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ท่ีใช้ชะ เพื่อไปแทนที่อิออ
นที่จับอยู่

7
- ใช้ pH หรือ salt gradient เพื่ อเพิ่ ม ประสิ ท ธิ ภ าพการ
แยก matrix ตัวกลางที่ใช้แยกสารแบ่งออกตามประจ้ ชัว่ คราว

รูป ที ่ 6 (บน) แสดงประจุ ของหม่่ ทีอ


่ ย่่ บน stationary phase
ที ่ นิ ย ม ใ ช้ ไ ด้ แ ก่ diethylaminoethyl (DEAE) กั บ
carboxymethyl (CM) (ล่าง) แสดงการเปลีย
่ นแปลงความจุ
ของประจุที ่ pH ต่างๆ

8
Gel filtration Chromatography
มี ชื่ อ เ รี ย ก อี ก อ ย่ า ง อื่ น ว่ า Gel permeation ห รื อ Size-
Exclusion chromatography มี ห ลั ก การแยกตามขนาด (และ
รูปร่าง) โมเลก้ลของสาร ดังรูปที่ 7 และได้ผลออกมาดังรูปที่ 8

ร้ปที่ 7 แสดงการแยกสารตามขนาดด้วยวิธี gel filtration


chromatography
(void volume = ปริ ม าตรของ mobile phase ก่ อ นที ่

สารจะออกมาจากคอลัมน์)
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

9
ร้ปที่ 8 Chromatogram ของวิธี Gel filtration
chromatography
(จาก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

ส ภ า ว ะ ที่ ใ ช้ ใ น ก า ร แ ย ก จ ะ เ ป็ น แ บ บ mild, non-denaturing


conditions ซึ่งเหมาะสมสำาหรับการแยกโปรตีนที่มีน้ ำาหนั กโมเลก้ลต่างกัน
นอกจากนั้ นยังใช้สำาหรับ
- การขจัดเอาเกลือออก (Desalting)
- โปรตีนที่แยกโดยวิธีน้ ี ยังคงโครงร่าง Quaternary อยู่
- สามารถใช้ ห า molecular weight ของสารได้ โดย
เทียบกับ standard protein ที่ทราบ molecular weight

10
(จาก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

ชนิ ดของ matrix ที่ใช้ในการ form stationary phase :


- cross-linked dextran polymer (Sephadex G-

10 ถึง G-200)
- cross-linked polyacrylamide (Biogel P-2 ถึ ง

P-300)

Affinity chromatography
Retention เกิ ด จาก biospecific interaction ระหว่ า ง ligand
ซึ่งเกาะอยู่บน dextran หรือ cellulose matrix กับโมเลก้ลของ
สารผสม

ตารางที่ 1 แสดงชนิ ดของสารที่ต้องการแยกกับ ligand จำาเพาะที่


เคลือบบน Stationary phase
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

11
สารที่ต้องการแยก ligand
enzyme Substrate, coenzyme, reversible
competitor
antigen Antibody
hormone Receptor, binding protein
receptor Effector molecules eg. hormone,
neurotoxin

การชะสารออก ทำาได้โดยการแทนที่ด้วยสารละลายที่มีอยู่ ligand


อยู่ แต่วิธีน้ ี สารที่ต้องการแยกจะจับกับ ligand ตอนถูกชะออก
มา จึงนิ ยมใช้การชะโดยการเปลี่ยนแปลง pH เพื่อไปรบกวนการ
จับระหว่าง ligand กับสารนั้ น

12
ร้ ป ที่ 9 การเชื่ อม ligand ให้ เ กาะอยู่ บ นผิ ว ของ matrix ใช้
cyanogen bromide
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Qualitative Chromatographic analysis

- Paper & Thin Layer Chromatography

ระยะทางที่สารเคลื่อนที่
Retardation factor (Rf) =
ระยะทางที่ตัวทำาละลาย
เคลื่อนที่

เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานที่เคลื่อนที่ควบคู่กันไปข้างๆ
- อาจมองเห็ น จ้ ด ที่ ส ารเคลื่ อนที่ ไปโดยการฉี ดพ่ น สาร (เช่ น
พวก ninhydrin สำาหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน)

13
Quantitative chromatographic analysis
- GLC and HPLC

ใช้วิธี calibrate เทียบกับ standard ทีท


่ ราบ
molecular weight แล้ววัดพืน
้ ทีใ่ ต้กราฟ (peak area)

(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

14
เครื่องมือ GLC and HPLC ปั จจ้บัน จะแสดงผล และคำาณวณความ
เข้มข้นของสารออกมาได้เลย

เอกสารอูางอิงและแนะนำาอ่านเพิ่มเติม
1. http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Sec
tion3/section3.html
2. http://gc.discussing.info/gs/b_theory
3. http://www.chem.vt.edu/chem-
ed/sep/tlc/tlc.html
4. http://www.chromatography.co.uk/techniqs/Bio/
bio_003.htm

15

You might also like