Professional Documents
Culture Documents
วัตถุประสงค์การเรียนรู้
1. เพื่อให้นักศึกษามีความรู้ ความเข้าใจในหลักการของวิธีโครมาโตกราฟี
แบบต่างๆ
2. เพื่อให้นักศึกษาเข้าใจความหมายของศัพท์เทคนิ คพื้ นฐานที่
ใช้ในวิธีโครมาโตกราฟี แบบต่างๆ
3. เพื่อให้นักศึกษาสามารถเลือกวิธีการแยกสารโดยโครมาโตกราฟี ที่
เหมาะสมได้
โครมาโตกราฟี (Chromatography)
Chromatography เป็ นเทคนิ คที่ นิย มใช้ใ นการแยกสารชีว
โมเลก้ล เนื่ องจากมีหลักการประย้กต์ใช้ได้หลากหลาย และสาร
ที่แยกได้น้ ั น สามารถนำามาวิเคราะห์หรือวัดปริมาณได้ทันที แล้ว
ยังสามารถเตรียมสารในปริมาณมากได้
ผ ล ลั พ ธ์ ข อ ง ก า ร แ ย ก ส า ร โ ด ย วิ ธี โ ค ร ม า โ ต ก ร า ฟี เ รี ย ก ว่ า
‘Chromatogram’ (รูปที่ 1)
1
a.
b.
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
2
- แรงฉ้ ด ของ mobile phase ซึ่ ง จะพาโมเลก้ ล ของสาร
เ ค ลื่ อ น ไ ป เ ร็ ว ห รื อ ช้ า ขึ้ น กั บ ค้ ณ ส ม บั ติ ก า ร ล ะ ล า ย (Liquid
chromatography) หรือการระเหย (Gas Chromatography)
3
ร้ปที่ 2 แสดง Retension mechanism ในการแยกสารโดยวิธี
Chromatography แบบต่างๆ
(S= สารที่ต้องการแยก, ลูกศรไปกลับ = แรงระหว่าง mobile
phase และ stationary phase)
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
Partition Chromatography
โมเลก้ลของสารผสมจะกระจาย (partition) ระหว่าง liquid
stationary phase และ mobile phase mobile phase
อาจเป็ นของเหลว (LC, HPLC) หรือเป็ นกาซ (GLC)
Retention ขึ้นกั บสมด้ ลระหว่ างการละลายของโมเลก้ ล ใน
stationary phase และการเข้ ามาอยู่ ใ น mobile phase (รู ปที่
3)
4
ร้ปที่ 3 การละลายของโมเลก้ลสารใน stationary phase และ
การเข้ามาอยู่ใน mobile phase
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
[ความเข้มข้นของสารที่ละลายใน
Partition coefficient, KD =phase]
stationary
[ความเข้มข้นของสารที่ละลายใน mobile
phase]
5
Adsorption Chromatography
สารที่ ล ะลายใน liquid (หรื อ gas) phase จะ interact
กั บ ผิ ว ข อ ง ส า ร จำา พ ว ก Hydroxyapatite (Ca3(PO4)2,
Ca(OH)2), alumina (Al2O3), Magnesium carbonate ซึ่ ง
นิ ยมใช้เคลือบบนแผ่นแก้ว สำาหรับ TLC
หมู่ท่ีมีข้ ัวบนสารเคลือบแผ่นแก้ว จะสร้างพันธะไฮโดรเจน
กับสารที่ต้องการแยกซึ่งละลายใน organic solvent
การชะสารทำาโดยเพิ่ม potarity ของตัวทำาละลายเช่น ถ้าให้
acetonitrite (CH3CN) ก็ ใ ห้ เ ติ ม methanol (CH3OH) เพื่ อไป
แย่ ง จั บ กั บ สารเคลื อ บบนแผ่ น แก้ ว บางครั้ง ก็ ใ ช้ ก ารชะแบบ
Gradient (รูปที่ 4)
6
Ion-exchange chromatography
สารจะถูกดึงไว้โดยแรงดึงดูดระหว่าง หมู่ บน stationary phase
ซึ่ ง มี ป ร ะ จ้ ต ร ง ข้ า ม กั บ ส า ร ที่ ต้ อ ง ก า ร แ ย ก ion-exchange
chromatography มี 2 แ บ บ คื อ Anion-exchange แ ล ะ
Cation-exchange ซึ่ ง เรีย กตามประจ้ ข องสาร แต่ ค อลั ม น์ จ ะ
บรรจ้ด้วย stationary phase ที่มีประจ้ตรงข้าม (รูปที่ 5,6)
การชะสารทำาได้โดย
- การเปลี่ ย นแปลง pH เพื่ อจะ neutralize หมู่ ท่ี มีประจ้
ทั้งที่อยู่บนโมเลก้ลของสารและบน stationary phase
- เพิ่มความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ท่ีใช้ชะ เพื่อไปแทนที่อิออ
นที่จับอยู่
7
- ใช้ pH หรือ salt gradient เพื่ อเพิ่ ม ประสิ ท ธิ ภ าพการ
แยก matrix ตัวกลางที่ใช้แยกสารแบ่งออกตามประจ้ ชัว่ คราว
8
Gel filtration Chromatography
มี ชื่ อ เ รี ย ก อี ก อ ย่ า ง อื่ น ว่ า Gel permeation ห รื อ Size-
Exclusion chromatography มี ห ลั ก การแยกตามขนาด (และ
รูปร่าง) โมเลก้ลของสาร ดังรูปที่ 7 และได้ผลออกมาดังรูปที่ 8
สารจะออกมาจากคอลัมน์)
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
9
ร้ปที่ 8 Chromatogram ของวิธี Gel filtration
chromatography
(จาก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
10
(จาก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
10 ถึง G-200)
- cross-linked polyacrylamide (Biogel P-2 ถึ ง
P-300)
Affinity chromatography
Retention เกิ ด จาก biospecific interaction ระหว่ า ง ligand
ซึ่งเกาะอยู่บน dextran หรือ cellulose matrix กับโมเลก้ลของ
สารผสม
11
สารที่ต้องการแยก ligand
enzyme Substrate, coenzyme, reversible
competitor
antigen Antibody
hormone Receptor, binding protein
receptor Effector molecules eg. hormone,
neurotoxin
12
ร้ ป ที่ 9 การเชื่ อม ligand ให้ เ กาะอยู่ บ นผิ ว ของ matrix ใช้
cyanogen bromide
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
ระยะทางที่สารเคลื่อนที่
Retardation factor (Rf) =
ระยะทางที่ตัวทำาละลาย
เคลื่อนที่
เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานที่เคลื่อนที่ควบคู่กันไปข้างๆ
- อาจมองเห็ น จ้ ด ที่ ส ารเคลื่ อนที่ ไปโดยการฉี ดพ่ น สาร (เช่ น
พวก ninhydrin สำาหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน)
13
Quantitative chromatographic analysis
- GLC and HPLC
(จ า ก
http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)
14
เครื่องมือ GLC and HPLC ปั จจ้บัน จะแสดงผล และคำาณวณความ
เข้มข้นของสารออกมาได้เลย
เอกสารอูางอิงและแนะนำาอ่านเพิ่มเติม
1. http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Sec
tion3/section3.html
2. http://gc.discussing.info/gs/b_theory
3. http://www.chem.vt.edu/chem-
ed/sep/tlc/tlc.html
4. http://www.chromatography.co.uk/techniqs/Bio/
bio_003.htm
15